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免疫組化問題解答

1、染色過強？

原因
解決方法
抗體濃度過高或孵育時間過長
降低抗體滴度、抗體孵育時間：室溫1小時或4度過夜
孵育溫度過高超過37度
一般在室溫20-28度
DAB顯色時間過長或濃度過高
顯色時間不超過5-12分鐘，以顯微鏡下觀察為準

2、非特異性背景染色？

原因
解決方法
操作過程中沖洗不充分
每步沖洗3次每次5分鐘
組織中含過氧化物酶未阻斷
可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時間延長
組織中含內原性生物素
正常非免疫動物血清再封閉
血清蛋白封閉不充分
血清蛋白封閉不充分

3、染色弱？

原因
解決方法
抗體濃度過低、孵育時間過短
提高抗體濃度、孵育時間不能少于60分鐘
試劑超過有效使用時間
應更換試劑
操作中添加試劑時緩沖液未瀝干
每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液
使試劑稀釋（應防止切片干燥）
室溫太低，低于15度
要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘或4度冰箱過夜
蛋白封閉過度
封閉不要超過12分鐘

4、染色陰性？

原因
解決方法
操作步驟錯誤
應重試，設陽性對照
組織中無抗原
設陽性對照以驗證試驗結果
一抗與二抗種屬連接錯誤
仔細確定一抗二抗種屬無誤

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